SÉQUENÇAGE DES ISOFORMES

SÉQUENÇAGE DES ISOFORMES

Présentation – Qu'est-ce que le séquençage d'une isoforme de transcrit ?

Les isoformes de transcrit sont des ARNm qui sont codés par la même séquence d'ADN mais qui diffèrent du point de vue des sites d'initiation de la transcription (TSS), des séquences codant les protéines ou des régions non traduites (UTR). Chez les eucaryotes supérieurs, quasiment tous les gènes multi-exons produisent des variants de transcrit par le biais de processus de régulation tels que l'épissage alternatif, les promoteurs alternatifs ou la polyadénylation alternative. Ces isoformes de transcrit sont susceptibles d'altérer la fonction des gènes et la stabilité de l'ARN ainsi que de produire des protéines dont la structure, la fonction ou la localisation sub-cellulaire varie. Une génération déréglée des variants d'épissage peut entraîner le développement de nombreuses maladies répandues. Il est essentiel de comprendre parfaitement l'ensemble du répertoire des isoformes de l'ARNm pour comprendre la biologie d'un organisme. 

Malgré l'importance de l'épissage alternatif, la détermination globale des isoformes de transcrit reste délicate. La technologie PacBio de séquençage nouvelle génération de lectures longues a pour but de résoudre les problèmes associés à l'assemblage des transcrits en développant des procédures et process de séquençage de l'ARN pour les transcrits d'ARNm pleine longueur. Les protocoles de séquençage d'isoformes (Iso-SeqTM) PacBio permettent de produire des lectures longues de plusieurs kilobases couvrant la totalité du transcrit de l'extrémité 5' à la queue polyA. Ces lectures pleine longueur permettent d'identifier des isoformes entières avec une exceptionnelle précision. La plateforme de séquençage d'une seule molécule PacBio propose une observation directe et non biaisée de la diversité des transcrits, que ce soit de manière globale ou ciblée. La technique Iso-SeqTM permet aux chercheurs d'avoir une vision sans précédent de la transcription alternative et d'améliorer l'annotation des génomes ainsi que l'identification des gènes.

Applications – Quels sont les avantages du séquençage d'une isoforme ?

Le séquençage d'une isoforme de transcrit permet des recherches sur l'ARN nécessitant : 

  • Le séquençage direct de transcrits pleine longueur dans n'importe quel organisme sans nécessiter de référence 
    • L'analyse pangénomique ou ciblée de la diversité des transcrits afin d'explorer la fréquence et les types d'événements d'épissage alternatif
    • Des études sur l'expression des gènes allèle-spécifiques
    • Des informations sur l'expression différentielle des isoformes entre des cellules, des tissus et des stades de développement, des états de santé ou de stress particuliers
    • Des annotations du génome améliorées
    • L'identification de nouveaux gènes et de nouvelles isoformes
    • L'identification des promoteurs et des sites d'épissage pour mieux comprendre la régulation des gènes
    • L'estimation précise de l'abondance des transcrits à l'échelle du gène ou de l'isoforme

Procédures et process - Méthodes & technologies de séquençage d'une isoforme de transcrit

Le séquençage de l'ARN (RNA-Seq) employant la technologie « lectures longues » implique la transcription inverse de l'ARN isolé en ADNc pleine longueur. Cette étape est suivie par une amplification de l'ADNc à grande échelle et par la génération de banques d'ADNc choisies en fonction de leur taille. Ces banques sont ensuite séquencées sur une plateforme PacBio en utilisant la technologie SMRT (single molecule real time). Après la réaction de séquençage, les lectures d'ADNc pleine longueur sont identifiées par la présence à la fois des amorces d'ADNc 5’ et les extensions polyA précédant les amorces 3’. Les lectures générées à partir des mêmes isoformes sont regroupées pour générer une séquence consensus initiale dont les erreurs sont corrigées pour supprimer les lectures qui ne sont pas pleine longueur afin de générer une séquence consensus finale d'excellente qualité. Ces lectures de grande qualité sont alignées par rapport à une référence ou les isoformes consensus de novo sont prédites avec des algorithmes spécialement conçus à cet effet.

Comparison between short-read technology and PacBio's Iso-SeqTM solution to identify mRNA isoforms

Expertise scientifique : séquençage d'une isoforme de transcrit

GATC Biotech est l'un des rares prestataires de services complets de séquençage d'ADNc pleine longueur. Son équipe de R&D est parvenu à optimiser les protocoles d'Iso-Seq originaux de PacBio afin de produire de longues lectures de séquençage ne nécessitant qu'une reconstruction et des efforts d'assemblage minimes. Le service de séquençage d'isoformes de GATC Biotech associe l'expertise des équipes et une connaissance exclusive de la préparation des banques d'ADNc pleine longueur, du séquençage et de l'analyse des données bioinformatiques pour proposer une solution complète permettant d'explorer la complexité du transcriptome entier.   

Publications concernant le RNA-Seq

Cliquez ici pour obtenir une liste d'articles scientifiques choisis en lien avec les solutions de séquençage de GATC Biotech.

Solutions associées au séquençage des variants de transcrits

Vous êtes intéressé(e) par le profil de l'hétérogénéité des transcrits de votre organisme d'intérêt ? Vous étudiez les mécanismes régulant l'expression des gènes comme l'épissage alternatif ? Alors profitez de notre service tout-en-un pour l'analyse pangénomique des variants de transcrits d'ARNm. De la préparation de banques au séquençage sur plateforme PacBio à l'analyse bioinformatique experte, en passant par l'établissement d'un rapport GATC d'analyse des données final et complet, nous vous aidons à progresser rapidement et facilement dans vos recherches sur l'ARN. 

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Autres documents à lire concernant le séquençage d'une isoforme de transcrit

Gonzalez-Garay, Manuel L et al. (2016) Introduction to Isoform Sequencing using Pacific Biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation 9:141-160.

Tilgner H et al. (2014). Defining a personal, allele-specific, and single-molecule long-read transcriptome. PNAS 111(27):9869-9874.

ISO-SEQ™ est une marque déposée de Pacific Biosciences Inc., Menlo Park, USA.