SÉQUENÇAGE SANGER

SÉQUENÇAGE SANGER

Présentation – Qu'est-ce que le séquençage Sanger ?

Le séquençage Sanger, également connu en tant que « séquençage par terminaison de chaîne » ou « séquençage dideoxy », fait référence en matière de séquençage de l'ADN depuis son invention dans les années 1970. Ce processus est basé sur la détection des nucléotides marqués terminateurs de chaîne qui sont incorporés par ADN polymérase lors de la réplication d'une matrice.

Aperçu schématique séquençage Sanger

La méthode est largement employée pour faire avancer le domaine de la génomique fonctionnelle et comparative, de la génétique de l'évolution et de la recherche sur les maladies complexes. La technique « dideoxy » a notamment été employée pour le séquençage du premier génome humain en 2002. Parce qu'elle convient à la validation de routine des expériences de clonage au séquençage des fragments de PCR, la méthode Sanger reste une technique populaire auprès de nombreux laboratoires du monde entier. 

Applications – Quels sont les avantages du séquençage Sanger ?

Le séquençage Sanger de l'ADN est très répandu à des fins de recherche telles que :

  • le ciblage de régions génomiques de petite taille dans un plus grand nombre d'échantillons
  • le séquençage des régions variables
  • la validation des résultats des études de séquençage à haut débit (NGS)
  • la vérification des séquences plasmidiques, des inserts et des mutations 
  • le typage HLA
  • le génotypage des marqueurs microsatellites
  • l'identification des variants génétiques pathogènes simples

Procédures et process – Méthodes et techniques de séquençage Sanger

La technique « dideoxy » est basée sur la synthèse des brins d'ADN qui sont complémentaires à un brin d'ADN matrice. La réaction de séquençage fait appel à des désoxynucléoside triphosphates (dNTP) normaux et à des didésoxynucléoside triphosphates (ddNTP) modifiés pour l'élongation de brin. Les ddNTP sont chimiquement modifiés par un marqueur fluorescent et par un groupement chimique inhibant la formation de liaisons phosphodiester, ce qui entraîne la fin de l'extension de l'ADN par l'ADN polymérase à chaque fois qu'un ddNTP est incorporé. Les fragments d'ADN obtenus sont soumis à une électrophorèse capillaire durant laquelle les fragments migrent à différentes vitesses à travers une matrice de gel en fonction de leur taille. Chacun des quatre ddNTP modifiés est porteur d'un marqueur fluorescent distinct. Le signal fluorescent émis par chaque colorant fluorescent excité détermine l'identité du nucléotide dans la matrice d'ADN d'origine. 

Séquençage Sanger vs. séquençage à haut débit (nouvelle génération)

Le séquençage de l'ADN n'a pas cessé d'évoluer grâce à l'adaptation réussie du séquençage Sanger. L'établissement des techniques de séquençage seconde génération (NGS) et troisième génération a présenté des avantages substantiels par rapport à la méthode « dideoxy » traditionnelle. Le séquençage Sanger reste cependant très répandu dans ce domaine car il présente plusieurs avantages distincts. Il est spécifiquement préférable au NGS pour : 

  • le séquençage de gènes simples
  • le séquençage économique d'échantillons simples 
  • le séquençage de vérification pour une mutagenèse dirigée ou la présence d'inserts clonés
  • l'analyse de fragments plus longs (d'une longueur avoisinant 1000 pb) dans certains cas
  • le fait d'être moins sujet aux erreurs que le NGS dans certains cas

Le séquençage nouvelle génération est souvent considéré comme étant supérieur au séquençage Sanger, notamment pour atteindre des objectifs nécessitant :

  • l'interrogation simultanée rentable de plus de 100 gènes à la fois
  • la détection de nouveaux variants en augmentant le nombre de cibles séquencées par run
  • l'analyse d'échantillons avec de l'ADN en faible quantité
  • le séquençage de génomes entiers, notamment de génomes microbiens

Les laboratoires font souvent appel aux deux techniques (Sanger et NGS), le séquençage Sanger étant utilisé pour les petits projets de routine et le NGS permettant des séquençages à grande échelle. 

Expertise scientifique : Séquençage Sanger

Le séquençage Sanger fait partie de l'ADN de GATC Biotech. Fondée en 1990, la société a commercialisé GATC1500, la première plateforme à technologie de séquençage non radioactif, qui a servi à séquencer le premier génome de Saccharomyces cerevisiae. En 1996, la société a commencé par proposer des services de séquençage, posant ainsi plusieurs jalons qui feront date dans le domaine du séquençage. 

À ce jour, la société conserve sa position de leader en tant que prestataire de services de séquençage Sanger. Au cours des dernières années, les services de séquençage Sanger de GATC Biotech ont permis de répondre à de nombreuses interrogations sur des sujets allant du trafic membranaire à l'interférence CRISPR, en passant par les mutations tumorales et la composition des communautés microbiennes et bien d'autres encore. La société est également spécialisée dans les applications sur mesure de séquençage Sanger comprenant :

  • l'établissement d'une PCR avec ou sans conception d'amorces
  • un clonage
  • l'isolement de l'ADN
  • Bioinformatique : analyse SNP/indel, assemblage et cartographie
  • Séquençage Sanger conforme à la norme DIN EN ISO/IEC 17025
  • Génotypage – détermination des variants génétiques (SNP/indels) d'un individu pour tests identitaires, pharmacogénomique, dépistage des maladies, génétique des populations et analyse des profils d'échantillons d'ADN ; peut inclure l'analyse des polymorphismes de longueur des fragments de restriction (RFLP)
  • Extension d'amorce (Primer walking) – pour le séquençage d'ADN matrices longs (jusqu'à 7 kb) d'un bout à l'autre avec un procédé comprenant plusieurs cycles de séquençage, chaque cycle démarrant à partir d'une nouvelle amorce basée sur la séquence précédemment déterminée ; les applications comprennent le comblement des gaps, le séquençage de clones volumineux et la vérification des séquences 

Publications

Cliquez ici pour obtenir une liste d'articles scientifiques choisis en lien avec les solutions de séquençage de GATC Biotech, ainsi que les toutes dernières publications concernant le séquençage Sanger. 

Solutions relatives au séquençage Sanger

Les solutions GATC Biotech de séquençage Sanger peuvent traiter différents matériels de départ en tubes ou en plaques. Vos résultats de séquençage d'une qualité exceptionnelle sont disponibles en ligne dans les heures qui suivent via votre compte myGATC. 

Adoptez notre solution LIGHTRUN éprouvée pour vos échantillons d'ADN préalablement mélangés à une amorce et bénéficiez de lectures de séquençage jusqu'à 1100 nt en qualité Phred20. Option NightXpress disponible pour un service de séquençage ultra-rapide.

Pour les matrices les plus complexes, profitez de notre service SUPREMERUN avec protocoles optimisés pour séquences riches en GC, structures en épingle à cheveux et caractéristiques structurales secondaires inhibant fréquemment les réactions de séquençage. Analyse SNP et indel gratuite sur demande. Option NightXpress disponible pour optimiser les délais d'obtention de vos données.

Autre services disponibles sur demande pour vos projets de séquençage Sanger sur mesure : clonage, isolement de l'ADN, conception d'amorces, extension d'amorces et génotypage, y compris analyse de la longueur des fragments. 

Autres documents à lire concernant le séquençage Sanger

Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22(4), 629 – 643 (2001).

Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 74(12), 5463 - 7 (1977).

GATC Biotech. Sanger sequencing troubleshooting guide (2017).