SÉQUENÇAGE DU GÈNE DE L'ARNr 16S

SÉQUENÇAGE DU MICROBIOME

Présentation – Qu'est-ce que le séquençage du microbiome ?

L'analyse microbienne mettant en œuvre le séquençage de l'ARN ribosomique (ARNr) 16S est une méthode couramment appliquée à l'étude phylogénétique et taxonomique des bactéries. Le gène de l'ARNr 16S est le marqueur génétique le plus connu utilisé pour identifier et classer les bactéries, notamment parce qu'il se compose à la fois de régions très bien conservées et de régions hypervariables. Les régions conservées peuvent servir de sites de liaison d'amorces universelles pour l'amplification du gène entier ou de fragments du gène, tandis que les régions hypervariables contiennent des séquences spécifiques à l'espèce qui peuvent faire la distinction entre différentes bactéries et archées.

Analyse de microbiome contre l'analyse de métagénome

Avec plus de 100 000 séquences du gène de l'ARNr 16S disponibles dans les bases de données publiques, l'amplification et le séquençage de l'ADNr 16S peuvent décrire de manière semi-quantitative les bactéries présentes dans des échantillons biologiques complexes. La méthode est considérée par beaucoup comme la référence en matière d'analyse des communautés bactériennes entières et de leurs membres. Le séquençage du gène de l'ARNr 16S bactérien peut être employé pour traiter des échantillons environnementaux et cliniques et avoir différentes utilités dans des domaines allant de l'assurance qualité des produits alimentaires à la recherche sur le microbiote intestinal. 

Applications - Quels sont les avantages du séquençage du gène de l'ARNr 16S ?

La détermination de la séquence d'ADN du gène de l'ARNr 16S est la méthode privilégiée pour étudier la taxonomie des membres du microbiome et du microbiote car elle peut être employée afin de :

  • caractériser les bactéries non cultivables
  • établir le profil de centaines de micro-organismes à partir d'une seule analyse
  • procéder à une semi-quantification de l'abondance relative des membres du microbiome
  • étudier des microbiomes complexes 
  • réaliser une classification plus rapide et plus précise qu'avec les procédés d'identification traditionnels comme le clonage et la mise en culture
  • identifier des bactéries en faible abondance
  • multiplexer des échantillons microbiens, permettant ainsi une caractérisation plus rentable du microbiome

Procédures et process - Méthodes & techniques de séquençage microbien des amplicons d'ARNr 16S

Le séquençage du gène de l'ARNr 16S est un type de séquençage d'amplicons. Plus particulièrement, le gène est partiellement ou totalement amplifié avec des amorces universelles spécifiques aux régions conservées. Les jeux d'amorces sont conçus pour capturer le plus grand nombre possible de micro-organismes différents. Les fragments amplifiés sont ensuite analysés par séquençage à haut débit (NGS). 

Les lectures obtenues sont regroupées avec d'autres séquences associées suivant un niveau d'identité prédéfini puis quantifiées. Ces groupes de lectures de séquençage similaires sont appelés « unités taxonomiques opérationnelles » (OTU). Le comptage des OTU est résumé dans un tableau répertoriant l'abondance relative pour chacune des bactéries dans chaque échantillon et les données sont exploitées pour un traitement en aval. Un niveau d'identité de séquence de 97 % est fréquemment choisi pour représenter l'espèce et de 95 % pour représenter le genre. L'identification microbienne s'effectue par rapport aux séquences de bases de données de référence comme le RDP (Ribosomal Database Project). En raison de la nature de leur séquence de gène d'ARNr 16S, certaines bactéries et archées ne peuvent être classées que jusqu'à l'échelon du genre ou de la famille. 

Séquençage d'amplicons de l'ARNr 16S vs. métagénomique

Trois techniques sont actuellement utilisées pour réaliser la classification taxonomique des organismes présents dans les microbiomes. Le séquençage Sanger de l'ADNr 16S est la technique habituelle pour caractériser les communautés microbiennes. Une autre approche ciblée courante fait appel au NGS pour déterminer la séquence des gènes ribosomiques. La troisième méthode, à savoir le séquençage du métagénome, implique d'isoler l'ADN total du matériel de départ puis de réassembler les lectures de séquençage par NGS pour reconstituer les génomes bactériens d'origine. 

Toutes ces approches présentent des avantages et des inconvénients. Alors que l'ARNr 16S peut présenter des biais par amplification inégale des espèces, le séquençage du métagénome pourrait être moins performant pour détecter les espèces rares dans une communauté microbienne. Les données du gène de l'ARNr 16S peuvent aussi saisir une plus grande partie de la diversité du microbiome, mais avec une sensibilité et une résolution moins bonnes que celles des données métagénomiques. Le séquençage Sanger n'est efficace que pour de petits nombres d'échantillons peu complexes - cette approche est limitée en termes de longueur et implique des procédures et process complexes. L'objectif du projet de recherche conditionne souvent la méthode à employer pour analyser le profil microbien. 

Expertise scientifique: analyse du profil du microbiome

GATC Biotech a été le tout premier à mettre sur pied un service clé en main (de l'échantillon aux données) dédié à l'analyse du profil du microbiome. Nous avons ainsi acquis une expérience inégalée dans les projets de recherche sur les microbes, notamment dans le séquençage du gène de l'ARNr 6S. Grâce à deux puissants outils s'appuyant sur deux technologies différentes, les services de séquençage d'ADN bactérien proposés par GATC Biotech comptent parmi les solutions les plus recherchées par les clients. INVIEW MICROBIOME PROFILING 2.0 utilise la plateforme Illumina pour caractériser, avec une grande sensibilité, les taxons très rares jusqu'à l'échelon du genre. Cette solution est idéale pour assurer la couverture approfondie des échantillons microbiens. INVIEW MICROBIOME HIGH SPECIFICITY fait appel à la technologie SMRT de PacBio (séquençage en temps réel d'une seule molécule) pour séquencer des amplicons de 16S pleine longueur et permettre la classification des communautés microbiennes jusqu'à l'échelon de l'espèce. Cette solution se prête bien à l'analyse des microbiomes très complexes.

L'an dernier, GATC Biotech a participé à d'autres études sur les bactéries visant à montrer les mécanismes d'action du régime alimentaire sur les intestins de différents organismes allant des rats aux termites, sur la caractérisation des micro-organismes dégradeurs du pétrole et sur la classification des bactéries isolées à partir de terre de verger, parmi bien d'autres études à portée environnementale et humaine. 

Publications

Cliquez ici pour obtenir une liste d'articles scientifiques choisis en lien avec les solutions de séquençage de GATC Biotech, ainsi que les toutes dernières publications concernant l'étude du microbiome.

Projets d'étude du microbiome

GATC Biotech est fier de participer au programme de recherche clinique FORECEE dont l'objectif est de développer un procédé de dépistage des cancers gynécologiques. Ce projet réunit quatorze partenaires, sous la houlette du University College London. Ce projet en partenariat a pour but de prédire les risques individuels de développer un cancer en s'appuyant sur la caractérisation des marqueurs moléculaires présents dans des cellules du col de l'utérus isolées à partir de frottis vaginaux classiques. GATC Biotech contribue au projet en analysant les microbiomes vaginaux de 3600 patientes. L'ADN isolé à partir de frottis vaginaux est séquencé via le service complet INVIEW MICROBIOME PROFILING 2.0 de GATC Biotech afin de déterminer la composition bactérienne des échantillons. 

Solutions relatives au séquençage microbien

Vous souhaitez faire progresser vos recherches sur le microbiome via le séquençage d'amplicons d'ARNr 16S ? Découvrez donc nos solutions complètes dédiées à l'étude du microbiome. Nos deux solutions proposent l'isolement de l'ADN, la préparation de banques, le séquençage sur l'une ou l'autre des meilleures plateformes Illumina ou PacBio, une analyse bioinformatique et un rapport d'analyse des données GATC de tous les résultats sous différents formats, y compris sous forme de graphiques et de tableaux.

Découvrez comment notre solution INVIEW MICROBIOME peut vous aider à faire évoluer votre projet de microbiologie ou contactez-nous pour plus d'informations. Les amorces validées ITS1 et ITS2 sont également disponibles pour une classification taxonomique au-delà de l'ARNr 16S.

Pour les cas où seuls quelques gènes issus d'un petit nombre d'échantillons doivent être interrogés, découvrez comment nos services de séquençage Sanger peuvent vous aider dans votre tâche. 

Si vous souhaitez obtenir une vision plus précise de votre communauté bactérienne sans le biais dû à la PCR mais en expliquant certains aspects fonctionnels, alors le séquençage d'un métagénome entier est peut-être la solution qu'il vous faut. Découvrez comment notre service de métagénomique  peut vous aider à trouver une réponse à vos questions.

Autres documents à lire concernant le séquençage microbien

Cox, M.J., Cookson, W.O., Moffatt, M.F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum. Mol. Genet. 22(R1), R88 – 94 (2013).

Shah, N., Tang, H., Doak, T.G. , Ye, Y. Comparing bacterial communities inferred from 16S rRNA gene sequencing and shotgun metagenomics. Pac. Symp. Biocomput.  doi: 10.1142/9789814335058_0018 (2011).