BISULFITE SÉQUENÇAGE

SÉQUENÇAGE APRÉS TRAITEMENT BISULFITE (BS-SEQ)

Présentation – Qu'est-ce que la technique WRBS (whole-genome bisulfite sequencing) ?

La 5-méthylcytosine (5mC) est l'un des sites de l'ADN humain les plus fréquemment méthylés. Dans le cas des végétaux, la 5mC se concentre au niveau des séquences CpG, CHG et CHH (où H est A, C ou T). Chez les vertébrés, on retrouve la 5mC principalement dans les îlots CpG, où la méthylation intervient dans divers processus tels que la régulation de l'expression des gènes, le développement embryonnaire et la carcinogenèse. Des techniques récentes de diagnostic non invasif consistent à utiliser l'état épigénétique d'un ADN acellulaire comme biomarqueur diagnostique du cancer. 

Le séquençage du génome entier après traitement bisulfite (WGBS) ou le séquençage après traitement bisulfite (Bisulfite-Seq ou BS-Seq) combine un traitement bisulfite et un séquençage à haut débit (NGS) pour l'analyse épigénétique du méthylome de presque tous les organismes par résolution à la base près. Pour les vertébrés, seule cette technique propose une couverture des îlots CpG dans le génome entier. Cette méthode est considérée par le Consortium international de l'épigénome humain comme le « gold standard » en matière d'identification du profil épigénomique.

Applications - Quels sont les avantages de l'analyse BS-Seq ?

Le séquençage du génome entier après traitement bisulfite est considéré comme le nec plus ultra de l'analyse quantitative de la méthylcytosine puisque cette technique permet aux chercheurs :

  • d'observer simultanément les schémas de méthylation de tous les sites CpG, CHG et CHH présents dans l'échantillon d'intérêt
  • de comparer les loci différentiellement méthylés issus de différents échantillons (par exemple : témoins sains vs. patients cancéreux)
  • d'obtenir des corrélations entre la méthylation des cytosines et la régulation transcriptionnelle
  • d'analyser les méthylations héritées de pratiquement n'importe quel organisme
  • d'établir le profil des méthylations de l'ADN dans le méthylome entier dans le cadre d'études sur le développement, la différenciation cellulaire, le cycle cellulaire, la réparation de l'ADN ou l'empreinte génomique 
  • d'analyser l'effet collectif des niveaux de méthylation sur le cancer, l'auto-immunité, etc.

Procédures et process - Méthodes & techniques de WGBS

Le BS-Seq est la méthode de prédilection pour obtenir une analyse complète des schémas de méthylation dans le génome. Le processus en plusieurs étapes emploie la conversion au bisulfite, l'amplification par PCR et le séquençage à haut débit pour déterminer les sites de méthylation sur l'ensemble du méthylome.

Le traitement chimique de l'ADN avec du bisulfite de sodium transforme les cytosines non méthylées en uraciles. Les cytosines méthylées sont protégées par leur groupement méthyle contre la transformation par le bisulfite, c'est pourquoi elles restent intactes au cours du processus de conversion. L'ADN est ensuite soumis à une amplification par PCR au cours de laquelle tous les uraciles sont transformés en thymidines. Les amplicons obtenus sont séquencés avec une excellente couverture de séquençage. Les lectures de séquençage obtenues sont cartographiées par rapport à un génome de référence pour permettre d'identifier les loci méthylés dans l'échantillon. 

Détection des cytosines méthylées par conversion chimique par traitement bisulfite
Figure 1 : Détection des cytosines méthylées par conversion chimique par traitement bisulfite

Puce Méthylation vs.séquençage du génome entier après traitement bisulfite

Les puces Méthylation sont une technique traditionnelle d'évaluation du statut de méthylation des cytosines. Cette méthode est utilisée pour cibler des centaines de milliers de sites de méthylation plutôt que d'explorer l'épigénome entier.

Le fait de ne cibler que les régions méthylées connues réduit l'analyse informatique du test ; les puces Méthylation pâtissent également d'inconvénients majeurs comparativement à la technique WGBS. Certains de ces inconvénients incluent :

  • des possibilités limitées pour explorer des organismes autres que les humains
  • une incapacité à détecter à la fois les mutations génétiques et les modifications épigénétiques 
  • l'analyse exclusive de régions génomiques prédéterminées
  • un danger de réactivité croisée avec des régions génomiques non ciblées ou des loci contenant des polymorphismes d'un seul nucléotide (SNP)
  • la nécessité d'effectuer une analyse informatique supplémentaire afin de contrôler les effets batch

Expertise scientifique : BS-seq

GATC Biotech travaille avec des plateformes de séquençage ultramodernes pour proposer une analyse approfondie de la méthylation sur le génome entier. Avec une analyse bioinformatique complète, GATC Biotech est en mesure d'offrir une flexibilité inégalée dans l'obtention de résultats fiables à diverses fins de recherche allant de la recherche sur le cancer aux processus cellulaires fondamentaux.

GATC Biotech est impliqué dans l'exploration des mécanismes épigénétiques à des fins cliniques. GATC Biotech a par exemple pour but d'exploiter les différences des signatures de méthylation de l'ADN entre cellules saines et cellules cancéreuses pour affiner le diagnostic et améliorer la prise en charge thérapeutique du cancer du sein et de l'ovaire (voir aussi le projet EpiFemCare financé par l'UE). 

Publications

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Services associés à l'analyse BS-seq

Aimeriez-vous constater par vous-même les avantages de cette méthode ? Obtenez très facilement des résultats fiables pour votre analyse du méthylome grâce à notre offre de service tout-en-un INVIEW EPIGENOME BS-SEQ. Nous proposons l'extraction de l'ADN à partir de différents matériels de départ, la préparation de banques expertes, un séquençage sur plateforme Illumina ultramoderne, une analyse bioinformatique et un rapport final détaillé de l'analyse des données GATC.

Autres documents à lire concernant le séquençage du génome entier après traitement bisulfite

Hsieh, T.F. Whole-genome DNA methylation profiling with nucleotide resolution. Methods Mol. Biol. 1284, 27 – 40 (2015).

Johnson, M.D., Mueller, M., Game, L., Aitman, T.J. Single nucleotide analysis of cytosine methylation by whole-genome shotgun bisulfite sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21:Unit21.23  (2012).

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