APPROCHE MULTI-PLATEFORMES

APPROCHE MULTI-PLATEFORMES

Présentation - Approche multi-plateformes du séquençage

Une approche multi-plateformes du séquençage à haut débit (NGS) comprend l'analyse combinée de lectures de séquençage générées sur deux plateformes de séquençage différentes ou davantage. La plupart du temps, les chercheurs ayant besoin de lectures très longues avec un taux d'erreur très faible optent pour cette stratégie de séquençage. L'accès physique à toute une gamme d'instruments de séquençage ainsi que les connaissances techniques permettant d'appréhender diverses techniques de séquençage sont des éléments essentiels pour mettre en œuvre une approche de séquençage hybride dans de bonnes conditions. 

L'association de lectures longues PacBio et de lectures plus courtes Illumina ayant un faible taux d'erreurs constitue un exemple réussi de fusion des lectures de séquençage issues de différents systèmes de séquençage. Cette méthode multi-plateformes est réputée pour la finition des génomes entiers d'eucaryotes, pour identifier des régions génomiques complexes, pour phaser des haplotypes et pour caractériser des produits de transcription ayant une forte identité de séquence. 

Applications - Avantages d'un séquençage multi-plateformes

Une approche hybride du séquençage à haut débit peut déboucher sur : 

  • une meilleure correction des erreurs
  • un nombre réduit de mésappariements
  • un plus grand nombre de régions génomiques correctement cartographiées 
  • un assemblage du génome complet
  • l'analyse de séquence d'ADNc pleine longueur 
  • un génotypage plus précis
  • l'identification de nouveaux changements conformationnels entre les cellules cancéreuses

Techniques et instruments de séquençage

GATC Biotech utilise dans ses laboratoires l'ensemble des plateformes de séquençage les plus modernes. Les instruments Illumina de pointe et la fameuse plateforme PacBio peuvent être utilisés seuls ou combinés pour répondre aux exigences de séquençage d'un grand nombre de projets.

Techniques de séquençage à haut débit 

GATC Biotech a été le premier prestataire de services de séquençage multi-plateformes au monde à proposer dès le départ des services de NGS à la fois sur systèmes Roche et Illumina. 

GATC Biotech a commencé par proposer des services de NGS basés sur la technique de pyroséquençage sur systèmes Roche. Le pyroséquençage consiste à détecter par chimiluminescence les pyrophosphates libérés durant la synthèse de l'ADN. Les ADN des banques ayant des adaptateurs spécifiques sont dénaturés en brins individuels et enrichis avec des billes d'amplification par une PCR en émulsion. Au cours d'une synthèse ultérieure de l'ADN, à chaque fois que l'ADN polymérase incorpore un nucléotide complémentaire à la matrice d'ADN, une molécule de pyrophosphate est libérée et transformée en ATP. La molécule d'ATP fournit de l'énergie pour une réaction enzymatique générant de la lumière. Puisque les nucléotides sont ajoutés progressivement et que l'on connaît leur identité, il est possible de déterminer la séquence de la matrice. 

GATC Biotech a ensuite rapidement maîtrisé une autre technique de séquençage par synthèse (SBS) développée à l'origine par Solexa puis par Illumina. Cette méthode comprend la fixation d'une banque à l'aide d'adaptateurs, la dénaturation en brins individuels et l'amplification par pontage pour former des clusters de fragments d'ADN. La banque est ensuite épissée dans des brins individuels et séquencée. Lors du séquençage, chacun des quatre types de nucléotides modifiés pour contenir un colorant fluorescent clivable et un groupe bloquant labile est ajouté séquentiellement. Au cours de l'incorporation des nucléotides, un signal fluorescent est émis et enregistré afin de déterminer la séquence d'ADN matrice. 

Depuis lors, GATC Biotech a également incorporé une approche de séquençage troisième génération, à savoir la technologie SMRT (séquençage en temps réel d'une seule molécule). Ce séquençage emploie des cellules SMRT contenant un million de puits appelés « guides d'ondes en mode zéro » (ZMW). Une ADN polymérase est attachée au fond d'un ZMW avec une seule molécule d'ADN servant de matrice. La structure des ZMW crée un volume d'observation si faible qu'il ne permet de détecter qu'une seule incorporation de nucléotide. Pour la réaction de séquençage, on utilise quatre nucléotides marqués chacun à l'aide d'un colorant fluorescent différent. Lorsqu'une base est incorporée par la polymérase, l'étiquette fluorescente est libérée et le signal émis est enregistré en temps réel. La différence de temps entre deux incorporations peut communiquer d'autres informations sur les variations structurelles et les modifications épigénétiques de la séquence. 

Systèmes de séquençage à haut débit

Il existe plusieurs plateformes à haut débit (NGS) utilisant des technologies de séquençage correspondantes. Parmi les instruments réalisant un séquençage massif en parallèle les plus répandus, on compte les séquenceurs MiSeq et HiSeq d'Illumina appliquant la technologie SBS. Les plateformes PacBio fonctionnant avec la technologie SMRT constituent les systèmes de prédilection pour les lectures longues.

Expertise scientifique : Illumina MiSeq, Illumina HiSeq et PacBio RS II

En 2006, GATC Biotech est devenu le premier prestataire de services de séquençage à proposer une approche multi-plateformes bénéficiant des meilleures technologies du moment. En 2010, GATC Biotech a été la première société à installer le séquenceur HiSeq 2000 d'Illumina à des fins commerciales, puis le PacBio RS II un an plus tard. Grâce à des années d'expérience dans la manipulation des plateformes les plus connues, notre équipe est parfaitement rompue aux projets qui nécessitent l'un ou l'autre de ses systèmes de séquençage phares, ou bien les deux. 

Publications 

Cliquez ici pour obtenir une liste d'articles scientifiques choisis en lien avec les solutions de séquençage de GATC Biotech, ainsi que les toutes dernières publications concernant l'approche du séquençage multi-plateformes.

Solutions relatives au séquençage multi-plateformes

Convaincu(e) par le fait que cette approche multi-plateformes apportera une valeur ajoutée à votre projet de séquençage deuxième génération ? Essayez notre solutions NGSELECT pour bénéficier d'un maximum de flexibilité dans la génération et l'analyse de vos lectures de séquençage. 

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Veuillez nous contacter pour toute question concernant l'utilisation de nos plateformes de séquençage pour mener à bien vos projets. 

Autres documents à lire concernant le séquençage multi-plateformes

Jeong, H., Lee, D.H., Ryu, C.M., Park, S.H. Toward Complete Bacterial Genome Sequencing through the Combined Use of Multiple Next-Generation Sequencing Platforms. J Microbiol Biotechnol. 26(1):207-12 (2015).