16S rRNA ANALYSE

MIKROBIOM-SEQUENZIERUNG (16S rRNA ANALYSE)

Übersicht – Was ist Mikrobiom-Sequenzierung?

Die Mikrobiomanalyse durch Sequenzierung von 16S ribosomaler RNA (rRNA) ist eine gängige Methode zur Untersuchung der Phylogenie und Taxonomie von Bakterien. Das 16S-rRNA-Gen ist der besteingeführte genetische Marker für die Identifizierung und Klassifizierung von Bakterien; dies liegt vor allem daran, dass es sowohl aus hochgradig konservierten als auch aus hypervariablen Regionen besteht. Die konservierten Regionen können als universelle Primer-Bindungsstellen für die Amplifikation des gesamten Gens oder von Genfragmenten dienen, während die hypervariablen Regionen artspezifische Sequenzen enthalten, anhand derer zwischen unterschiedlichen Bakterien und Archaeen unterschieden werden kann.

Vergleich zwischen Mikrobiom- und Metagenom-Analyse

Dank der mehr als 100.000 Sequenzen des 16S-rRNA-Gens, die in öffentlichen Datenbanken zur Verfügung stehen, können durch 16S rDNA-Amplifikation und -Sequenzierung in komplexen biologischen Proben vorliegende Bakterien semiquantitativ beschrieben werden. Die Methode wird weithin als Goldstandard für die Analyse von kompletten Bakteriengemeinschaften und deren Organismen betrachtet. Anhand der Sequenzierung des bakteriellen 16S-rRNA-Gens können Umweltproben und klinische Proben gleichermaßen bearbeitet werden; die Methode dient verschiedenen Zwecken von der Lebensmittelqualitätssicherung bis zur Erforschung der Darmmikrobiota. 

Anwendungsbereiche – Welche Vorteile hat die Sequenzierung des mikrobiellen 16S-rRNA-Gens?

Die Ermittlung der DNA-Sequenz des 16S-rRNA-Gens ist die Standardmethode zur Untersuchung der Taxonomie von Organismen in einem Mikrobiom oder einer Mikrobiota, denn sie kann für folgende Zwecke eingesetzt werden:

  • Charakterisierung nicht kultivierbarer Bakterien
  • Profilerstellung von Hunderten von Mikroorganismen aus einer einzigen Analyse
  • Semi-quantitative Erfassung der relativen Häufigkeit der Organismen in einem Mikrobiom
  • Untersuchung komplexer Mikrobiome 
  • Raschere und genauere Klassifizierung als durch traditionelle Identifizierungsmethoden wie Klonen und Kultivierung
  • Identifizieren von Bakterien mit geringem Vorkommen
  • Kostengünstigere Mikrobiom-Charakterisierung durch Multiplexen mikrobieller Proben

Arbeitsablauf – Methoden und Techniken der Sequenzierung mikrobieller 16S-rRNA-Amplikons

Die Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens ist eine Amplikon-Sequenzierung. Genauer gesagt wird das gesamte Gen oder Teile davon mit universellen Primern amplifiziert, die für die konservierten Regionen spezifisch sind. Die Primer-Sets sind dazu ausgelegt, ein möglichst breites Spektrum an unterschiedlichen Mikroorganismen zu erfassen. Die amplifizierten Fragmente werden dann durch NGS (Sequenzierung der nächsten Generation) analysiert. 

Die resultierenden Reads werden mit anderen ähnlichen Sequenzen auf einem zuvor definierten Identitätsniveau zusammengefasst und dann quantifiziert. Diese Cluster von ähnlichen Sequenzierungs-Reads werden als „Operational Taxonomic Units“ (OTUs) bezeichnet. OTU-Zahlen werden in einer Tabelle mit relativen Häufigkeiten für jedes Bakterium in jeder Probe zusammengefasst und die Daten werden für die Weiterverarbeitung verwendet. Ein Sequenzidentitätsniveau von 97 % wird oft als repräsentativ für eine Art und von 95 % für eine Gattung gewählt. Die Identifizierung der Mikroorganismen erfolgt durch den Vergleich mit Sequenzen in Referenzdatenbanken wie dem Ribosomal Database Project. Manche Bakterien und Archaeen können auf Grund ihrer 16S-rRNA-Gensequenz nur bis zur Ebene der Gattung oder Familie klassifiziert werden. 

16S-rRNA-Amplikon-Sequenzierung im Vergleich zur Metagenomik

Für die taxonomische Klassifizierung von Organismen, die in Mikrobiomen vorkommen, werden üblicherweise drei Verfahren angewendet. Die Sequenzierung von 16S ribosomaler DNA nach Sanger ist die traditionelle Methode zur Charakterisierung von Mikrobengemeinschaften. Ein weiteres gängiges gezieltes Verfahren nutzt NGS zur Bestimmung der Sequenz von ribosomalen Genen. Die dritte Methode, die Metagenom-Sequenzierung, erfordert die Isolierung der gesamten DNA aus dem Ausgangsmaterial und anschließende Reassemblierung der beim NGS erhaltenen Reads in die ursprünglichen Bakteriengenome. 

Alle Methoden haben ihre Vor- und Nachteile. Während es beim 16S-rRNA-Verfahren durch ungleiche Amplifikation der einzelnen Arten zu Verzerrungseffekten kommen kann, ist die Metagenom-Sequenzierung möglicherweise weniger effizient, wenn es um die Erkennung seltener Arten in einer Mikrobengemeinschaft geht. 16S-rRNA-Gen-Daten können zudem eine breitere Diversität innerhalb des Mikrobioms erfassen, jedoch mit geringerer Empfindlichkeit und Auflösung im Vergleich zu Metagenom-Daten. Die Sequenzierung nach Sanger eignet sich nur für kleine Anzahlen von Proben mit geringer Komplexität; weitere Defizite der Methode sind Längenbeschränkungen und arbeitsreiche Abläufe. Oft wird durch das Ziel des Forschungsprojekts bestimmt, welches Verfahren der Mikrobenanalyse genutzt werden dürfte. 

Wissenschaftliche Expertise: Mikrobiom-Profiling

GATC Biotech war das erste Unternehmen mit einem Komplettservice. Die Dienstleistung umfasst die Probenvorbereitung bis hin zur Bereitstellung der Daten und ist auf Mikrobiom-Profiling ausgerichtet. Daher verfügen wir über eingägnige Erfahrungen mit Mikroorganismen-Forschungsprojekten, insbesondere mit der 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung. Mit zwei leistungsstarken Produkten, die auf zweierlei Technologien beruhen, gehören die Bakterien-DNA-Sequenzierungsdienstleistungen von GATC Biotech zu den gefragtesten Produkten des Unternehmens. INVIEW MICROBIOME PROFILING 2.0 verwendet die Illumina-Plattform zur Charakterisierung sehr seltener Taxa bei niedrigen Dichten bis hinunter zum Gattungsniveau. Dieses Produkt ist ideal für eine sehr weitgehende Abdeckung von Mikrobenproben. INVIEW MICROBIOME HIGH SPECIFICITY verwendet die SMRT-Technologie (Single Molecule and Real Time) von PacBio für 16S-Amplikon-Sequenzierung mit ultralangen Leselängen, was eine Klassifizierung von Mikrobengemeinschaften bis hinunter zum Artniveau ermöglicht. Dieses Produkt ist gut geeignet für die Analyse von hochkomplexen Mikrobiomen.

Publikationen

Unter Publikationen, finden Sie eine Liste ausgewählter Forschungsartikel (inklusive Artikel zum Thema Mikrobiom-Profiling), unterstützt von Sequenzierungsprodukten von GATC Biotech.

Mikrobiom-Profiling: Projekte

GATC Biotech ist am klinischen Forschungsprogramm FORECEE beteiligt, das sich zum Ziel gesetzt hat, ein Screening-Verfahren für Krebserkrankungen der Frau zu entwickeln. Vierzehn Partner unter der Leitung des University College London sind an dem Projekt beteiligt. Das Ziel des Partnerschaftsprojektes ist es, anhand der Charakterisierung von molekularen Markern in Zellen des Gebärmutterhalses, die aus regulären Abstrichen isoliert werden, das individuelle Krebsrisiko vorherzusagen. Der Beitrag von GATC Biotech zu diesem Projekt besteht in der Analyse des vaginalen Mikrobioms von 3.600 Patientinnen. Die aus dem Pap-Abstrich isolierte DNA wird mit Hilfe des Komplettservice INVIEW MICROBIOME PROFILING 2.0 von GATC Biotech sequenziert, um die bakterielle Zusammensetzung der Proben zu bestimmen. 

Produkte in Verbindung mit Mikrobiom-Sequenzierung

Würden Sie Ihre Mikrobiom-Forschung gerne durch 16S-rRNA-Amplikon-Sequenzierung voranbringen? Lernen Sie unsere beiden End-to-End-Lösungen für das Mikrobiom-Profiling kennen! Beide Produkte bieten DNA-Isolation, library-Präparation, Sequenzierung auf den führenden Plattformen Illumina oder PacBio, BioIT-Analyse sowie einen GATC-Datenanalysebericht aller Ergebnisse in verschiedenen Formaten, einschließlich Grafiken und Tabellen.

Sehen Sie, wie Ihr Mikrobiologie-Projekt mit Hilfe unseres Produkts INVIEW MICROBIOME gefördert werden kann – für weitere Informationen stehen wir Ihnen gerne zur Verfügung. Für taxonomische Klassifizierungen, die über 16S rRNA hinausgehen, stehen die validierten Primer ITS1 und ITS2 zur Verfügung.

Für Fälle, in denen nur wenige Gene in einer kleinen Anzahl von interessierenden Proben abgesucht werden sollen, können Sie aus unseren Sequenzierungsdienstleistungen nach Sanger Nutzen ziehen. 

Wenn Sie ein noch tieferes Verständnis Ihrer Bakteriengemeinschaft erlangen möchten – ohne PCR-Bias, aber mit funktionellen Einblicken –, dann ist die Gesamt-Metagenom-Sequenzierung der richtige Ansatz für Sie. Unser Metagenomik-Service gibt Ihnen die Antworten, die Sie brauchen.

Weiterführende Literatur zum Thema Mikrobiom-Sequenzierung

Cox, M.J., Cookson, W.O., Moffatt, M.F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum. Mol. Genet. 22(R1), R88 – 94 (2013).

Shah, N., Tang, H., Doak, T.G. , Ye, Y. Comparing bacterial communities inferred from 16S rRNA gene sequencing and shotgun metagenomics. Pac. Symp. Biocomput.  doi: 10.1142/9789814335058_0018 (2011).