GESAMT-RNA-SEQ

GESAMT-RNA-SEQ

Übersicht – Was ist Gesamt-RNA-Seq?

Möchte man ein wirklich vollständiges Bild von Transkriptomen erhalten, müssen alle RNA-Transkripte eines Organismus berücksichtigt werden – unabhängig davon, ob es sich um kodierende oder nicht-kodierende RNA handelt. Zu diesem Zweck muss die gesamte RNA eines Organismus isoliert werden, nicht nur Teile davon wie etwa Messenger-RNA (mRNA). Da die ribosomale RNA (rRNA) nicht weniger als 98 % des Transkriptoms ausmacht, wird die rRNA oft abgereichert, um die Anzahl von Reads zu optimieren, welche die eigentlich interessierende RNA abdecken. Die Gesamt-Transkriptom-Sequenzierung findet zahlreiche Anwendungen in der Forschung, darunter etwa die Entdeckung neuer RNA-Spezies und Untersuchungen von untranslatierten Bereichen und Exongrenzen.

Arbeitsablauf: Total RNA-Seq

Anwendungsbereiche – Welche Vorteile hat die Gesamt-Transkriptom-Sequenzierung?

Gesamt-RNA-Seq hat Vorteile für Forscher, die folgenden Zielen nachgehen:

  • Erlangung eines möglichst umfassenden, genomweiten Bildes des Transkriptoms
  • Genkartierung durch UTR und durch Charakterisierung von Exongrenzen
  • Analysieren von Spleißmechanismen und alternativen Spleißmechanismen
  • Untersuchen von Transkriptomen menschlichen und nicht-menschlichen Ursprungs

Arbeitsablauf – Methoden und Techniken der Gesamt-Transkriptom-Sequenzierung

Alle RNA-Seq-Methoden, auch die Gesamt-RNA-Sequenzierung, weisen ähnliche Arbeitsabläufe auf. RNA wird isoliert, cDNA wird revers transkribiert, die cDNA wird fragmentiert, Adapter werden an die cDNA-Fragmente ligiert, die schließlich sequenziert werden (Single-End- oder Paired-End-Sequenzierung). Anschließend werden die Reads einem Referenz-Transkriptom zugeordnet oder de novo assembliert, damit ein detailliertes Profil mit Auflösung auf Einzelbasenniveau entsteht.

Schematische Übersicht cDNA-Synthese aus RNA mittels reverser Transkriptase

Die Gesamt-RNA-Seq unterscheidet sich von anderen Transkriptom-Sequenzierungsstrategien, da diese Methode die Sequenzierung sowohl von kodierender als auch von nicht-kodierender RNA erlaubt. Anstatt eine poly(A)+-Selektion zu durchlaufen, die auf die mRNA-Spezies abzielt, wird häufig die gesamte RNA einer rRNA-Abreicherung unterzogen. Da rRNA einen großen Prozentsatz der gesamten RNA ausmacht, hilft eine Reduzierung der rRNA dabei, mehr Sequenzierungs-Reads interessierenden Transkripten zuzuordnen. cDNA wird aus dem Rest der rRNA-abgereicherten RNA synthetisiert. Optional können während der Weiterverarbeitung strangspezifische Informationen bereitgestellt werden. Die cDNA wird dann wie in allen anderen RNA-Seq-Arbeitsabläufen behandelt. 

Bei der Isoformen-Sequenzierung (Iso-Seq) können ohne Umbau oder die Notwendigkeit für komplizierte Algorithmen vom 5'-Ende des Transkripts bis zum Poly-A-Schwanz vollständige cDNA-Sequenzen erzeugt werden. Dieser Ansatz basiert auf der Single-Molecule Real-Time (SMRT) -Technologie für die Erzeugung von ultralangen Reads. 

Gesamt-RNA-Seq im Vergleich zu mRNA-Sequenzierung 

Sequenzierungstechniken für lange RNA, Gesamt-Transkriptom-Sequenzierung und mRNA-Sequenzierung sind leistungsfähige Methoden für die Analyse des Transkriptoms. Der in einem bestimmten Fall jeweils zu verwendende Transkriptom-Sequenzierungsansatz richtet sich nach dem Ziel.

Gesamt-RNA-Seq wird verwendet, wenn sämtliche RNA-Transkripte eines Organismus analysiert werden müssen. Dieser Ansatz eignet sich für die Erforschung aller RNA-Spezies. mRNA-Sequenzierung kann nur für die Analyse des kodierenden Teils des Genoms eingesetzt werden. Da diese RNA nur 1 – 4 % des Transkriptoms ausmacht, kann eine Anreicherung von mRNA die Menge der zur Exonanalyse gehörigen Reads stark erhöhen. Wichtig ist, dass die Empfindlichkeit gegenüber auf niedrigeren Niveaus exprimierten mRNA-Transkripten ebenfalls erhöht wird.   

Vollständige Transkripte von menschlichen, pflanzlichen und tierischen Transkriptomen können ebenfalls mit unserem Iso-Seq-Service erzielt werden.

Wissenschaftliche Expertise: Gesamt-RNA-Seq

GATC Biotech ist seit vielen Jahren ein zuverlässiger Anbieter von Transkriptom-Sequenzierungsdienstleistungen einschließlich der Gesamt-RNA-Sequenzierung. Mit erweiterter Sequenzabdeckung und unserer ausgezeichneten BioIT-Analyse können wir Ihnen helfen, neue Varianten und alternative Spleißmechanismen in nahezu jedem interessierenden Genom zu entdecken. Mit den Dienstleistungen von GATC Biotech erhalten Sie strangspezifische Daten von Transkriptomen ohne die Notwendigkeit von klar definierten Referenzsequenzen. Unsere Kompetenz im Bereich SMRT-Technologie mit ihren ultralangen Leselängen hat vor kurzem De Novo-Transkriptomanalysen und Isoformen-Charakterisierung durch vollständige cDNA-Sequenzanalyse ermöglicht. In den letzten Jahren leisteten die Transkriptom-Sequenzierungsdienste von GATC Biotech wichtige Beiträge u. a. zur Aufklärung von Mechanismen der Zahnschmelzbildung, der minimalen Überlebensvoraussetzungen des Staphylococcus aureus sowie von Abwehrmechanismen gegen Insektizide. 

Publikationen

Unter Publikationen, finden Sie eine Liste ausgewählter Forschungsartikel (inklusive Artikel zum Thema Transkriptomik), unterstützt von Sequenzierungsprodukten von GATC Biotech.

Produkte in Verbindung mit Transkriptom-Sequenzierung

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Weiterführende Literatur zum Thema Gesamt-Transkriptom-Sequenzierung

Jiang, Z. et al. Whole transcriptome analysis with sequencing: methods, challenges and potential solutions. Cell Mol Life Sci. 72(18):3425-39 (2015).

Morozova, O., Hirst, M., Marra, M.A. Applications of New Sequencing Technologies for Transcriptome. Annu Rev Genomics Hum Genet. 10: 135-151 (2009).