FLÜSSIGBIOPSIE

FLÜSSIGBIOPSIE

Übersicht – Was ist eine Flüssigbiopsie (engl.liquid biopsy)?

DNA und RNA-Fragmente werden in Körperflüssigkeiten wie Blut und Urin über verschiedene physiologische Prozesse freigesetzt. Die sogenannte zellfreie DNA (engl. cell-free DNA oder cfDNA) und zellfreie RNA (engl. cell-free RNA oder cfRNA) werden zusammenfassend als zirkulierende Nukleinsäuren in Plasma und Serum (engl. circulating nucleic acids in plasma and serum oder CNAPS) bezeichnet. Die Hauptquelle der cfDNA im Körper ist die passive Freisetzung aus Zellen, durch Mechanismen wie Apoptose und Nekrose, sowie aktive Sekretion aus lebenden Zellen. Die Größe der meisten cfDNA-Fragmente liegt im Bereich zwischen 180 und 200 bp. Die Halbwertszeit der zellfreien DNA beträgt weniger als zwei Stunden, bevor sie von der Milz, Leber und Nieren aus dem Blutkreislauf herausgefiltert werden.

Wie gesunde Zellen, setzen auch primäre und metastatische Krebszellen DNA-Fragmente in den Blutkreislauf frei. Die resultierende zirkulierende Tumor-DNA (engl. circulating tumour DNA, ctDNA) ist durch genetische Defekte, wie Punktmutationen, Chromosomenaberrationen, anomale epigenetische Muster oder durch Kopienzahlanomalien, gekennzeichnet.

Die genetischen Defekte in ctDNA sind in hoher Übereinstimmung identisch mit denen im Tumorgewebe, und grundverschieden von zirkulierender DNA aus gesunden Gewebe. Da ctDNA repräsentativ für das gesamte Tumorgenom ist, wird die Analyse von ctDNA aus flüssigem Probenmaterial häufig als Ganzkörper-Biopsie oder Flüssigbiopsie bezeichnet.

Grafik: Freisetzung von ctDNA-Fragmenten in den Blutkreislauf
Abbildung 1. Tumore können Fragmente von ctDNA in den Blutkreislauf absondern, wo sie im Plasma nachweisbar sind. Die Analyse der ctDNA in Blutproben von Krebspatienten erlaubt die Identifizierung spezifischer Mutationen, welche prognostische oder therapeutische Auswirkungen haben können.

Andere Bestandteile des Blutes, die als Tumor-Surrogate herangezogen werden können, umfassen zirkulierende Tumorzellen, zirkulierende miRNA, Exosomen und zirkulierende Vesikeln.

Anwendungsbereiche – Welche Vorteile hat die Flüssigbiopsie?

Die Verwendung von zellfreier DNA birgt ein großes diagnostisches Potential für verschiedene klinische Szenarien. Die meiste Aufmerksamkeit erhält derzeit die Verwendung von cfDNA zur nicht-invasiven Identifizierung und Überwachung von Krebserkrankungen.

Zellfreie DNA als Biomarker für Krebs

Die Fähigkeit, zirkulierende Tumor-DNA aus einer einfachen Blutprobe zu isolieren, ermöglicht einen schnellen, kostengünstigen und nicht-invasiven Zugang zu einer molekularen Analyse, die genaue Veränderungen im Tumor reflektiert. Diese Eigenschaften von ctDNA eröffnet eine Reihe von verschiedenen Anwendungen in der Onkologie.

Schema: Ablauf Tumordiagnostik

Der klinische Nutzen von ctDNA-Analysen zur Krebserkennung beinhaltet:

  • Beurteilung der molekularen Heterogenität
  • Identifizierung von spezifischen genomischen Veränderungen für personalisierte Behandlung
  • Überwachung der Tumorlast
  • Früherkennung von Therapieresistenz
  • Nachweis von minimaler Resterkrankung
  • Risikobewertung einer Metastasierung oder erneuten Erkrankung
  • Aufklärung von Resistenzmechanismen

Flüssigbiopsien als Ersatz für die klassische Gewebsbiopsie

Gewebebiopsie ist derzeit der Standard für die molekulare Diagnose von Krebs. Der Ansatz beinhaltet die Untersuchung von Tumorgewebe, die durch eine kleine Nadel (Nadelbiopsie) oder einen chirurgische Eingriff gewonnen wird. Die molekulare Diagnostik von DNA-Mutationen wird dann direkt in frischen Gewebeproben oder häufig in Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben (FFPE) durchgeführt.

Tumorheterogenität und klonale Evolution stellen eine große Herausforderung bei der Entwicklung wirksamer Behandlungsstrategien auf Basis von Gewebebiopsien dar.  Ein wichtiges Kriterium für die molekular zielgerichtete, personalisierte Krebstherapie ist die serielle Überwachung der Krebsgenetik. Aufeinanderfolgende Gewebebiopsien eines Tumors, um dessen Entwicklung und Heterogenität zu untersuchen, sind oft schwierig, riskant und kostenintensiv, wenn nicht sogar unmöglich. Daher besteht die Notwendigkeit für neue Ansätze, effizient die Heterogenität und Dynamik eines Tumors im Verlauf einer Behandlung zu ermitteln.

Die jüngsten Fortschritte in der Genomanalyse von ctDNA aus Blutproben ermöglichen einen kostengünstigen und nicht-invasiven Ansatz zur Krebserkennung und Überwachung in Echtzeit. Neben anderen molekularen Erkenntnissen liefert diese neuartige Diagnoseverfahren wichtige ergänzende Informationen über therapeutische Ziele und Arzneimittelresistenzmechanismen bei Patienten, die vom Krebs betroffen sind.

Weitere Anwendungen der ctDNA-Analyse

Die Analyse der cfDNA in der Onkologie kann sie auch für andere medizinische Bereiche nutzbringend eingesetzt werden. Die Analyse von zellfreier fetaler DNA ist ein etabliertes Verfahren zur nicht-invasiven Pränataldiagnostik (NiPt). Die Untersuchung der fetalen DNA im Blut der Mutter kann Punktmutationen und Aneuploidie bereits 7 Wochen nach der Empfängnis diagnostizieren. In Europa wird NiPt für das pränatale Screening seit 2012 verwendet.

Je nach Herkunft, kann die zellfreie DNA im Plasma auch als Indikator für die Erreger von Infektionen, neurodegenerativen Autoimmun- und Herz-Kreislauf- Erkrankungen oder als frühes Warnzeichen von Abstossungsreaktionen nach Transplantationen dienen.

Arbeitsablauf – Wie funktioniert die Analyse von Flüssigbiopsie-Proben?

Die derzeitigen Flüssigbiopsie-Tests basieren auf der Untersuchung von Biomarkern in zellfreier DNA, zirkulierenden Tumorzellen oder Exosomen. Andere prognostische und prädiktive Marker für Krebs in einem frühen Stadium der Entwicklung umfassen zellfreien RNA-Fragmente, methyliert ctDNA und miRNA.

Ein besonders vielversprechender Ansatz für die Risikobewertung bei Krebspatienten ist, aufgrund der Verfügbarkeit, der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens und der hohen Spezifität und Sensitivität der resultierenden Daten, die Untersuchung von cfDNA in Blutplasma. Für die Analyse gibt es verschiedene Ansätze. Die  Sequenzierung des Gesamtgenoms oder des Exoms bietet den umfassendsten Überblick an tumorassoziierten Mutationen, aber mit geringerer Empfindlichkeit. Gezielte Ansätze, die auf spezifische genomische Aberrationen fokussieren, bieten eine höhere Empfindlichkeit, aber keinen Zugang zu molekularen Informationen außerhalb der vordefinierten Zielregionen. Mutationen, die am häufigsten in gezielten Ansätzen genutzt werden, umfassen EGFR, PIK3CA, KRAS, BRAF, TP53, HER2, GNA11, KIT, MAP2K1, NRB und andere.

Next-Generation Sequenzierung von ctDNA aus dem Blut folgt einem ähnlichen Workflow, unabhängig davon, ob bestimmte Ziele oder das gesamte Genom untersucht werden. Die Extraktion der cfDNA aus Plasma ist einer der wichtigsten Schritte und muss unter optimalen Bedingungen durchgeführt werden, um die Qualität für die Folgeschritte sicherzustellen. Im Anschluss an die DNA-Extraktion erfolgt die Library-Erstellung. Next-Generation Sequenzierung wird dann auf entsprechenden Plattformen durchgeführt und die daraus resultierenden Daten werden bioinformatisch ausgewertet. Die aufgearbeiteten Rohdaten stehen dann den klinischen Forschern für Ihre Arbeit zur Verfügung.

Arbeitsablauf: Sequenzierung von Flüssigbiopsieproben
Figure 2. Ablauf der nicht-invasiven ctDNA-Analyse mittels Next-Generation Sequenzierung.

Wissenschaftliche Expertise auf dem Gebiet der Flüssigbiopsie

GATC Biotech ist der erste Dienstleister, der die blutbasierte Tumorcharakterisierung als flexiblen Service anbietet.

Als Pionier auf dem Gebiet der nicht-invasiven Diagnostik, hat GATC Biotech bereits mehr als 40.000 Blut- und Plasmaproben unter Diagnostikbedingungen verarbeitet. Im Laufe der Jahre hat das Unternehmen einen eigenen hochoptimierten Prozess für eine effiziente Gewinnung winzigster Mengen an zellfreier DNA aus Plasma entwickelt und etabliert. Die DNA wird entweder in spezialisierten NGS-Workflows sequenziert oder mittels digitaler PCR (ddPCR) analysiert.

Alle Dienstleistungen verstehen sich als Komplettlösung von der Logistik, über transparente LIMS-gesteuerte Proben- und Datenverarbeitung, gefolgt von komfortabler Datenlieferung über die firmeneigene Online-Plattform myGATC. Alle GATCLIQUID Proben werden in GATC-eigenen Labors unter ISO 17025 Akkreditierung produziert. ISO 13485 Zertifizierung ist für spezielle Anwendungen verwendbar.  

Publikationen

Unter Publikationen, finden Sie eine Liste ausgewählter Forschungsartikel.

Wittenberger T. et al. (2014). DNA methylation markers for early detection of women’s cancer: promise and challenges. Epigenomics 6(3):311-327.

Produkte auf Basis der Flüssigbiopsie

Sie wollen Flüssigbiopsien in Ihre Krebsforschung implementieren? Finden Sie heraus, wie GATCLIQUID Services einfach in Ihre Studien integriert werden kann.

Je nach spezifischer Anforderung bietet GATC Biotech die folgenden Dienstleistungen an:

  • ONCOEXOME - für einen umfassenden Überblick über alle protein-kodierenden Regionen des Tumorgenoms
  • ONCOPANEL - für die gezielte Analyse von über 200 tumor-assoziierten Mutationen in 50 Genen.
  • ONCOTARGET - für die hochsensitive routinemäßige Überwachung einer Einzelmutation

Alle GATCLIQUID Dienstleistungen können mit Produkten für Gewebe- oder FFPE-Proben kombiniert werden (Abbildung 3). Die komplementäre Nutzung dieser Dienste ermöglicht Vergleichsstudien von DNA aus Tumorgewebe und Plasmaproben. Diese Proof-of-Concept-Studien sind für die klinische Validierung von Flüssigbiopsien dringend erforderlich.

Krebsforschungs-relevante Produkte
Figure 3. GATC Biotech’s Produktportfolio für die Krebsforschung.

Weiterführende Literatur zum Thema Flüssigbiopsie

Crowley E., Di Nicolantonio F., Loupakis F., Bardelli A. (2013). Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the bloodNat Rev Clin Oncol. 10(8): 472-484.

Diaz LA. Jr, Bardelli A. (2014). Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNAJ Clin Oncol. 32(6): 579-586.

Francis G, Stein S., 2015. Circulating cell-free tumour DNA in the management of cancerInt J Mol Sci. 15: 14122-1442.

Gold B, Cankovic M, Furtado LV, Meier F, Gocke CD., 2015. Do circulating tumor cells, exosomes and circulating tumor nucleic acids have clinical utility? J Mol Diagn. 17(3): 210-224.

Heitzer E., Ulz P., Geigl JB. (2015). Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin Chem. 61(1): 112-23.

Qin Y, Ljubimov VA, Zhou C, Tong Y, Liang J., 2016. Cell-free circulating tumor DNA in cancerChin J Cancer 35: 36.