REDUCED REPRESENTATION BISULFIT-SEQUENZIERUNG

REDUCED REPRESENTATION BISULFITE SEQUENCING

Übersicht – Was ist Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS)?

DNA-Methylierungen treten bei Wirbeltieren am häufigsten an Cytosinen in CpG-Inseln auf. Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) ist ein Verfahren zur Anreicherung dieser GC-reichen Teile von Säugetiergenomen. Die Technik kombiniert einen für die CpG-Motive spezifischen Restriktionsverdau und eine Bisulfit-Behandlung mit nachfolgender Sequenzierung; so wird auf wirtschaftliche Weise eine Methylierungsanalyse mit Einzelnukleotid-Auflösung erzielt.

RRBS ist besonders von Vorteil bei Studien, die wichtige Genommerkmale wie Promotoren untersuchen. Klinische Anwendung findet das Verfahren bei der Identifizierung von Biomarkern, indem es eine vergleichende Analyse von unterschiedlich methylierter genomischer DNA in verschiedenen Probengruppen ermöglicht (z. B. krankes im Vergleich zu normalem Gewebe).

Anwendungsbereiche – Welche Vorteile hat RRBS?

RRBS ist eine von vielen Epigenetikern bevorzugte Technik, die folgende Vorteile bietet:

  • Senkung der Kosten für die Sequenzierung im Vergleich zur Bisulfit-Sequenzierung des gesamten Genoms
  • Erhöhte Sequenzabdeckung für CpG-Inseln
  • Basenpaar-Auflösung für die Analyse der Cytosin-Methylierung
  • Quantitative Messungen der DNA-Methylierungsfrequenz
  • Eignung für Analysen komplexer DNA-Bereiche wie Wiederholungssequenzen, die mit der konventionellen Bisulfit-Sequenzierung eventuell schwierig zu erfassen sind

Arbeitsablauf – Methoden und Techniken des RRBS

RRBS beginnt mit einem Restriktionsverdau durch ein Enzym wie z. B. MspI. Dieses Restriktionsenzym erkennt spezifisch „CCGG“-Motive, die in genregulatorischen Elementen häufiger auftreten als im restlichen Genom. Wenn das Restriktionsenzym MspI die gesamte genomische DNA verdaut, so schneidet es häufiger an CpG-reichen Regionen; das Ergebnis sind kurze DNA-Fragmente aus diesen Regionen. Da andere Teile des Genoms weniger CCGG-Erkennungsstellen enthalten, schneidet MspI diese Abschnitte weniger häufig und es werden längere DNA-Fragmente vom restlichen Genom produziert. 

Die sich daraus ergebenden DNA-Fragmente werden nach ihrer Größe selektiert; längere Fragmente werden von der Weiterverarbeitung ausgeschlossen. Nur die CpG-reichen Inseln, die am häufigsten methyliert sind, werden durch Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) analysiert. 

Wissenschaftliche Expertise: RRBS

GATC Biotech erkannte rasch, welches Potenzial in der RRBS-Methode steckt und war eines der ersten Unternehmen, die diese Technik in ihren Labors übernahmen, um Sie kommerziell als Servicedienstleistung anzubieten.

Publikationen

Unter Publikationen, finden Sie eine Liste ausgewählter Forschungsartikel, unterstützt von Sequenzierungsprodukten von GATC Biotech, sowie die neuesten Publikationen zum Thema Epigenetik.

Produkte in Verbindung mit RRBS

Können CpG-Methylierungen mit Einzelnukleotid-Auflösung auf kostengünstige Weise analysiert werden? Ja – mit GATC‘s standardisierten Service-Paket für RRBS, einschließlich DNA-Isolierung, fachkundiger Erstellung einer Bibliothek, Sequenzierung auf der Illumina-Plattform, professioneller BioIT-Analyse und einem umfassenden Abschlussbericht zur GATC-Datenanalyse.

Sehen Sie, wie Ihr Säugetier-Epigenetik-Projekt mit Hilfe unseres Produkts INVIEW EPIGENOME gefördert werden kann – für weitere Informationen stehen wir Ihnen gerne zur Verfügung.

SIe benötigen Sequenzierdaten über das ganze Methylome? Dann könnte die Gesamtgenom-BS-Sequenzierung der richtige Service für Sie sein. 

Echtzeit-Erkennung von Basenmodifikationen wie 5-Methylcytosin, 4-Methylcytosin, 5-Methyladenin aus nicht-amplifiziertem Ausgangsmaterial ist auch mit Hilfe der SMRT-Sequenzierungstechnologie von PacBio möglich – mit unserem Produkt INVIEW MODIFICATION ANALYSIS.

Weiterführende Literatur zum Thema Reduced Representation Bisulfite Sequencing

Nagarajan, A., Roden, C., Wajapeyee, N. Reduced representation bisulfite sequencing to identify global alteration of DNA methylation. Methods Mol Biol. 1176, 23 – 31 (2014).

Meissner, A. et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res. 33(18), 5868-77 (2005).