BASENMODIFIKATIONSANALYSE

BASENMODIFIKATIONSANALYSE

Übersicht – Was sind Basenmodifikationen und warum sind sie wichtig?

Zu den epigenetischen Modifikationen zählen DNA-Methylierung, Histonmodifikation sowie ncRNA (nicht-kodierende RNA) -assoziiertes Gen-Silencing. Methylierte DNA trägt eine Methylgruppe (-CH3) an einer DNA-Base. Bekannte Modifikationen sind 5-Methylcytosin (5mC), 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) und N6-Methyladenosin (m6A). Technisch bedingt ist bisher nur die epigenetische Markierung 5mC gründlich untersucht worden. 

Die DNA-Methylierung spielt in wichtigen zellulären Prozessen wie z. B. der Regulierung von Genexpression und Stoffwechselwegen, DNA-Reparaturmechanismen, mikrobieller Virulenz und der Aufrechterhaltung der Chromosomenstabilität eine Rolle. Auf Grund ihrer Beteiligung an wesentlichen zellulären Vorgängen stehen abnorme epigenetische Modifikationen oft mit Erbkrankheiten, Krebs und der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen in Zusammenhang. 

Anwendungsbereiche – Welche Vorteile hat eine direkte Erkennung von epigenetischen Modifikationen?

Die Basenmodifikationsanalyse mit der Technologieplattform von PacBio ist eine einzigartige Methode zur Erforschung des Methyloms, denn sie bietet folgende Vorteile:

  • Untersuchung von Basenmodifikationen in nicht-amplifiziertem Ausgangsmaterial auf Einzelbasenniveau
  • Strangspezifischen Nachweis von 5-Methylcytosin, 4-Methylcytosin (4-mC), 6-Methyladenin (6-mA) und glykosyliertem 5-Hydroxymethylcytosin
  • Eine library für Sequenzierung und Erkennung modifizierter DNA
  • Simultane Analyse von SNPs, InDels und diversen Arten von Basenmodifikationen
  • Entdeckung neuartiger oder unerwarteter Modifikationen
  • Umfassenderes Verständnis der Regulierung von biologischen Prozessen und phänotypischer Variabilität

Arbeitsablauf – Methoden und Techniken zur Erkennung von DNA-Modifikationen

Die Analyse der häufig auftretenden epigenetischen Methylierung basiert auf dem indirekten Nachweis von DNA-Methylierungen durch Bisulfit-Sequenzierung. Zu den Einschränkungen bisulfitbasierter Techniken zählen schlechte Datenqualität auf Grund von unvollständiger Bisulfit-Konversion oder DNA-Abbau während der Bisulfit-Behandlung sowie das Unvermögen, zwischen 5mC und 5hmC zu unterscheiden. 

Zur Lösung dieser Probleme verwendet GATC Biotech die PacBio-Technologie. Mit der SMRT-Technologie ist man in der Lage, einen Schritt über die DNA-Sequenz hinauszugehen und detaillierte epigenetische Informationen aus dem Sequenzierlauf zu gewinnen. Aus nicht-amplifiziertem, unbehandelten Ausgangsmaterial können mehrere Modifikationen auf Einzelbasenniveau direkt erfasst werden.

Molekulare Strukturen ausgewählter Basenmodifikationen

Dier Erkennung von Basenmodifikationen mit der SMRT-Technologie von PacBio umfasst eine Analyse der Polymerase-Kinetik während der Sequenzierung. Wenn eine Polymerase auf eine Modifikation trifft, baut das Enzym das Nukleotid am gegenüberliegenden Strang langsamer ein. Diese Verlangsamung wird vom Computer als längere Pause zwischen Impulsen (Interpulse Duration, IPD) erkannt. Die resultierenden IPDs werden mit einer Kontrolle verglichen und ein „IPD-Verhältnis“ wird berechnet; anhand dessen können die modifizierten Nukleotide sowie die Modifikationen im sequenzierten Genom lokalisiert werden.

Wissenschaftliche Expertise: Modifikationsanalyse

GATC Biotech ist Vorreiter bei der Umsetzung neuer Technologien zur Verbesserung der epigenetischen Profilerstellung. Als zertifizierter PacBio-Dienstleister konzentriert sich das Unternehmen voll auf die nicht-selektive Erforschung der modifizierten Nukleotide über 5mC hinaus. Durch Bereitstellung einer direkten Methode der Profilerstellung von DNA-Modifikationen der Nukleotide 5mC, 5hmC und m6A bietet GATC Biotech eine spannende neue Option zur Erforschung weiterer Modifikationen im gesamten Genom. 

Publikationen

Unter Publikationen, finden Sie eine Liste ausgewählter Forschungsartikel, unterstützt von Sequenzierungsprodukten von GATC Biotech.

Projekte

Das KLEBSICURE-Konsortium

INVIEW MODIFICATION ANALYSIS wird für das KLEBSICURE-Konsortium eingesetzt. Konsortiumsmitglieder bei diesem Kooperationsprojekt sind die GATC Biotech AG, das Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie (Berlin) und das Ludwik-Hirszfeld-Institut für Immunologie und Experimentelle Therapie (Breslau); Konsortiumsführerin ist die Arsanis Biosciences GmbH (Wien). Hauptziel des Projekts ist die Identifizierung und Charakterisierung des Pathogens Klebsiella pneumoniae, das Auslöser schwerer Infektionen ist. Die Studie verwendet die De-novo-Sequenzierung in Kombination mit der direkten Erkennung von Basenmodifikationen, um die Virulenz des Pathogens zu untersuchen mit dem Ziel, die Entwicklung von Therapien mit monoklonalen Antikörpern zu lenken und ein Testverfahren für die klinische Diagnostik zu etablieren.

Produkte in Verbindung mit der Modifikationsanalyse

Wussten Sie, dass die Analyse von Basenmodifikationen auf Einzelbasenniveau ohne chemische Umwandlung oder DNA-Amplifikationsschritte möglich ist? Nutzen Sie zum Auffinden weiterer nicht-selektiver Modifikationen unser komplettes Dienstleistungspaket inklusive DNA-Isolierung, library-Präparation, Sequenzierung auf der führenden PacBio RS II-Plattform, professioneller BioIT-Analyse und einem umfassenden Abschlussbericht zur GATC-Datenanalyse. Sehen Sie, wie Sie mit unserem Produkt INVIEW MODIFICATION ANALYSIS Ihr Epigenetik-Projekt weiterentwickeln können.

Sind Sie an der Analyse der 5-Methylcytosine im gesamten Genom von nahezu jedem Organismus interessiert? Dann ist die Bisulfit-Sequenzierung (BS-Seq) für das gesamte Genom mit INVIEW EPIGENETICS BS-SEQ das richtige Produkt für Sie. 

Befassen Sie sich mit der Untersuchung des DNA-Methyloms eines Säugetiermodellorganismus? Dann kann unser Produkt INVIEW EPIGENETICS RRBS-SEQ Sie bei der Weiterentwicklung Ihrer Forschung unterstützen. 

Wenn Sie aktuell mit der Erforschung von DNA-Protein-Interaktionen befasst sind, dann entdecken Sie, wie Sie von unserem etablierten NGSELECT profitieren können. 

Weiterführende Literatur zum Thema Basenmodifikationsanalyse

Flusberg, B.A. et al. Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing. Nat Methods. 7(6), 461 – 5 (2010).

Zillner, K., Németh, A. Single-molecule, genome-scale analyses of DNA modifications: exposing the epigenome with next-generation technologies. Epigenomics 4(4), 403 – 14 (2012).

Clark, T.A. et al. Characterization of DNA methyltransferase specificities using single-molecule, real-time DNA sequencing. Nucleic Acids Res. 40(4):e29 (2012).