Transkriptom-Untersuchung

Qualitative und quantitative Expressionsanalysen

Ihr Transkriptomprojekt

Expressionsunterschiede zwischen verschiedenen Organismen, Entwicklungsstadien und Umweltbedingungen können mittels RNA-Sequenzierung umfassend analysiert und verglichen werden. Durch die Bestimmung der Transkript-Häufigkeit (Genexpressionslevel) und die Annotation kodierender SNPs können die spezifischen Phänotypen zugrundeliegenden Ursachen identifiziert und analysiert werden. Die hohe Reproduzierbarkeit und große dynamische Spannbreite der RNA-Sequenzierung ermöglichen ihren  Einsatz in vielen medizinischen und biologischen Forschungsgebieten.

Strategie

Um eine verlässliche Bestimmung der relativen Transkript-Häufigkeit zu erlangen und Expressionsprofile verschiedener Proben miteinander vergleichen zu können, ist eine ultratiefe Sequenzierung notwendig. Illuminas HiSeq 2000 kombiniert qualitativ-hochwertige Daten mit höchstem Durchsatz und ist deshalb ideal geeignet, um ganze Transkriptome in die Tiefe zu sequenzieren. Die Sequenzierung über die gesamte Transkript-Länge (full-length cDNA) ermöglicht es Polymorphismen in kodierenden Regionen zu detektieren und gleichzeitig die Häufigkeit der jeweiligen Gene zu bestimmen. Durch Erstellung spezieller 5‘- oder 3‘-UTR cDNA-Libraries können die hoch-polymorphen und informationsreichen untranslatierten Gen-Regionen gezielt untersucht werden. Die Verwendung von 5‘- oder 3‘-UTR-Libraries führt zudem zu einer Erhöhung der Sequenziertiefe. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit erhöht seltene, aber physiologisch relevante Transkripte zu detektieren.

Ausgangsmaterial

• Gewebe
• Gesamt-RNA
• mRNA
• cDNA

Proben-Vorbereitung

• Optional: mRNA Anreicherung / rRNA Abreicherung für Prokaryoten
• Random-geprimte cDNA-Synthese für die Sequenzierung von full-length cDNA
• + 3’- oder 5’-UTR cDNA-Libraries zur spezifischen Analyse der informationsreichen untranslatierten Bereiche und Erhöhung der Sequenziertiefe

Sequenzierung

• Illumina HiSeq 2000 | Single oder paired end-Sequenzierung für die SNP-Detektion und quantitative Expressionsanalysen

Bioinfomatik

• Rohdaten (fastq)
• Clustering
  • Cluster-Repräsentanten (fasta)
  • Cluster-Tabelle (tsv)
• Alignment
  • Alignment-Datei (sam, bam)
  • Hit-Tabelle (tsv)
  • Anzahl der Hits für das gleiche Transkripts (txt)
  • Tabelle aller SNPs (tsv)
• Probenvergleich
  • Vergleichstabelle inklusive rpm / rpkm-Wert (tsv)
  • Scatter Plot (pdf)

• Pre-Sequencing
• Single Reads
• Genome
• Targeted (re)-sequencing
• Human Sample Sequencing
• Transkriptome
  • > De novo Sequencing
  • > Re-Sequencing
• Metagenome
• Regulome

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