Individuell abgestimmte Strategien zur Beantwortung Ihrer wissenschaftlichen Fragestellung
Umfassende Transkriptom-Analysen mit neuesten Technologien
Ihr Transkriptomprojekt
Durch die de novo-Sequenzierung vollständiger Transkriptome können seltene oder noch unbekannte Transkripte entdeckt und unterschiedliche Splicevarianten und Fusionstranskripte charakterisiert werden. Außerdem können die Daten dazu verwendet werden, die Genom-Assemblierung und Annotation von bislang unbekannten Organismen zu verbessern.
Strategie
Um ein qualitativ hochwertiges und möglichst vollständiges Assembly der Transkripte zu erhalten, werden lange Reads benötigt. Durch einen einzelnen langen Read können ganze Transkripte, Exons und Splice-Junctions komplett abgedeckt werden und dadurch auch alternative Isoformen identifiziert werden. Um Expressionsunterschiede zwischen einzelnen Genen zu verringern, kann eine Normalisierung der cDNA-Libraries durchgeführt werden. Die Sequenzierung der normalisierten cDNA ermöglicht es, gesamte Transkriptome komplett zu erfassen und auch schwach exprimierte Transkripte zu detektieren.
Ausgangsmaterial
- Gewebe
- Gesamt-RNA
- mRNA
- cDNA
Proben-Vorbereitung
- Optional: mRNA Anreicherung / rRNA Abreicherung für Prokaryoten
- Oligo(dT)- oder random-geprimte cDNA-Synthese
- Normalisierung durch Denaturierung / Reassoziation der cDNA
Sequenzierung
- Roche GS FLX+ oder PacBio RS | Single Reads
- Verbesserung der Sequenzdaten durch zusätzliche Sequenzierung auf dem Illumina HiSeq 2000
Bioinformatik
- Rohdaten (fasta und fastq)
- Flowgrams (sff)
- Clustering mit cd-hit-est
- Cluster-Repräsentanten (fasta)
- Cluster-Tabelle (txt)
- Semiautomatisches Assembly mit dem GS de novo assembler
- Sequenz der Singletons und assemblierten Contigs (fasta)
- De novo assembly report (txt)
- Report und Statistiken zu Assembly und Contig-Coverage (txt)
- Blast gegen GenBank oder andere Datenbank
- Tabelle der Cluster / EST-Contig Annotationen (tsv)
Spotlight
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On the path to a deep understanding of the organism, two parameters are important to the interpretation of the Next Gen sequencing data: The use of various Next Gen systems to take advantage of each technology and the combination of different bioinformatic tools and their stepwise application.
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