Enrichment - Vollständige Probenvorbereitung und Sequenzierung @GATC

Deep Sequencing spezifischer Regionen bei einer großen Anzahl Proben

Ihr Anreicherungs-Projekt

Systematische Identifizierung von seltenen und häufigen SNPs, Insertionen und Deletionen in spezifischen Regionen, um genetische Variationen zwischen Individuen und ihre Korrelation mit bestimmten Phänotypen und Erkrankungen zu untersuchen.
 

Strategie

Die Möglichkeit, Zielregionen zwischen 200 kb und über 50 Mb in beinahe jedem Genom anreichern zu können, gestattet eine hoch flexible Projektgestaltung, ohne die Notwendigkeit tausende PCRs anzusetzen – von wenigen bis zu mehreren tausend Proben. Die Anreicherung individueller Zielregionen ermöglicht die gezielte Analyse spezifischer Kandidatengene. Verwenden Sie vordefinierte Bait-Designs für umfassende Exom- und Kinom-Untersuchungen am Menschen oder dem klassischen Modellvertebraten Maus. Zusätzlich können die bereits vorhandenen Anreicherungskits durch Hinzufügen eigener Inhalte individuell erweitert und an Ihre Erfordernisse angepasst werden. Die Anreicherung erfolgt über ein optimiertes Hybridisierungsverfahren in Lösung, bei dem lange RNA-Baits hoher Qualität eingesetzt werden.

Ausgangsmaterial

Genomische DNA

Proben-Vorbereitung

• Library-Präparation aus genomischer DNA für Illumina HiSeq 2000

Anreicherung

• Optional: Bait-Design mit Hilfe des Online-Design-Tools Agilent eArray
• Anreicherung unter Verwendung des geeignetsten Designs von Agilent Technologies:
  • SureSelectXT Custom (from 1 Kb to 24 Mb)
  • SureSelectXT Human All Exon V4
  • SureSelectXT DNA Kinome
  • SureSelectXT Mouse all Exon
• Hybridisierung
• Multiplexing (optional) zum Mischen unterschiedlicher Proben und anschließender gemeinsamer Sequenzierung

Sequenzierung

• Illumina HiSeq 2000 I Single- oder paired end-Reads zur Detektion von SNPs und kleineren Insertionen/Deletionen
• Je nach Projekt und Ausgangsmaterial mindestens 30x Coverage

Bioinformatik

• Pre-processing (Lieferung als bam- und bedgraph-Files)
  • Qualitätscheck der Sequenzdaten
  • Alignment zur Referenz
  • Read-Gruppierung
  • Entfernen der PCR-Duplikate
  • Lokales Realignment
  • Rekalibrierung der Qualitätswerte der Basen

• Detektion der Varianten
  • Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs): bekannte, neue und sortierte SNPs (tsv), alle SNPs (vcf)
  • Deletions- und Insertions-Polymorphismen (DIPs mit bis zu 5 bp); InDels (tsv und vcf)
• Post-processing (Lieferung als Zusammenfassung (png, pdf, txt))
  • Annotation
  • Filtern der Varianten
  • Sortieren der Varianten
  • Bestimmung der Coverage (reale Sequenzcoverage)

• Pre-Sequencing
• Single Reads
• Genome
• Targeted (re)-sequencing
  • > Enrichment
  • > Amplicons
• Human Sample Sequencing
• Transkriptome
• Metagenome
• Regulome

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