Amplikon-Sequenzierung – flexible Projektgestaltung kombiniert mit Hochdurchsatz-Sequenzierung

Hochsensitive Varianzanalysen 

Ihr Amplikon-Projekt

Systematische Identifizierung von seltenen und häufigen SNPs, Insertionen und Deletionen in komplexen und hochvariablen Proben. Phylogenetische Charakterisierung mikrobieller Ökosysteme und Subtypisierung von Viren.

Strategie

Die spezifische Amplifikation kleiner Zielregionen und anschließende ultratiefe Sequenzierung sind ideal geeignet für die Detektion von seltenen und häufigen Mutationen und deren Charakterisierung.

Während der Probenvorbereitung werden einzelne Amplikons (PCR-Produkte) innerhalb eines Gemisches mittels emPCR klonal amplifiziert. Dadurch können einzelne PCR-Produkte ohne aufwendige Klonierungsschritte direkt sequenziert werden. Der Roche GS FLX+ ist daher ideal geeignet zum Nachweis seltener Varianten (Nachweisgrenze < 1%) in hochkomplexen und heterogenen Proben. Zudem können aufgrund der langen Leseweite mehrere SNPs mit einem Read abgedeckt werden und somit auch Haplotypen bestimmt werden.

Flexible Projektgestaltung, sowie optionales Multiplexen und Mischen unterschiedlicher Proben ermöglicht die gezielte Untersuchung einer statistisch relevanten Probenzahl.

Ausgangsmaterial

• Genomische DNA
• PCR-Produkte
• PCR-Produkte mit spezifischen GS FLX+ Titanium Adaptoren (“ready to load”)

Proben-Vorbereitung

Adapter-Integration durch PCR mit lokus-spezifischen GS FLX+ Fusions-Primern

Sequenzierung

•    Roche GS FLX+ I Single Reads
•    Coverage in Abhängigkeit der benötigten Nachweis-Sensitivität

Bioinformatik

• Rohdaten (fasta und fastq)
• Flowgrams (sff)
• Mapping mit GS Reference Mapper (ace)
• Consensussequenz (fasta)
• Mappingreport (txt)
• Tabelle aller SNPs (tsv)

• Pre-Sequencing
• Single Reads
• Genome
• Targeted (re)-sequencing
  • > Enrichment
  • > Amplicons
• Human Sample Sequencing
• Transkriptome
• Metagenome
• Regulome

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